Orexin对蓝斑底核神经元活动的调控作用及机制研究
发布日期：2025-01-04 16:38 点击次数：149
Orexin，也称为hypocretin，是由外侧下丘脑区(lateral hypothalamic area, LHA)和穹隆周区(perifornical area, PeF)orexin神经元产生的一种肽类递质，自被发现以来，orexin与睡眠-觉醒调控的密切关系引起了广泛的关注。人的orexin能神经系统受损后引起嗜睡猝倒症，主要表现为觉醒维持困难[1]。因此，orexin既往被认为是一种觉醒肽。有意思的是，除了广泛投射到觉醒相关脑区，orexin神经元对睡眠相关脑区也有直接的纤维投射[2]，提示orexin可能参与了睡眠的调控。文献[3]报道中等强度的orexin纤维投射到与快速眼动(rapid eye movement, REM)睡眠转换和维持密切相关的蓝斑底核(sublaterodorsal tegmental nucleus, SLD)，且orexin能纤维末梢呈曲张体样地表达于SLD神经元周围。在SLD注射orexin，对于处于非快速眼动(non-rapid eye movement，NREM)睡眠期间的动物，orexin可以诱导出稳定的快速眼动(rapid eye movement, REM)睡眠[4]。以上实验证据表明orexin很有可能通过调控SLD参与了REM睡眠的调控，然而orexin调控SLD的机制尚不清楚。
中枢神经系统中神经元的活动是相关脑区行使高级功能的基础。既往离体膜片钳实验证明orexin可以通过去极化SLD神经元，使SLD神经元产生一个兴奋效应，从而影响SLD神经元的功能[5]。然而，在体情况下决定一个神经元功能的因素除了神经元膜电位的变化，还有一系列因素，例如神经元的放电以及神经元膜电位的阈下振荡等。已有研究表明，orexin可以通过调控神经元膜电位的阈下振荡，增加神经元的放电效率，甚至促进神经元网络的同步化放电[6]。业已证明，SLD神经元普遍存在各个频段的阈下膜电位振荡，这种振荡可以规范神经元放电的模式[7]，使SLD神经元网络的放电更加高效和同步，而SLD脑区神经元网络的高效同步化放电是REM睡眠转换和维持的核心机制。因此，orexin对SLD神经元膜电位水平、膜的特性以及膜电位阈下振荡的调控效应以及相关的生理意义值得进一步研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物
在免疫荧光组织化学实验中所使用的实验动物均为体质量在300~350 g之间的SPF级的成年SD雄性大鼠，而在膜片钳实验中所使用的实验动物均为出生后8~14 d之间的SPF级SD乳大鼠。以上所有实验动物均取自于陆军军医大学实验动物中心。
1.2 主要试剂和仪器
人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF), 配方(mmol/L)：NaCl 120，KCl 3，NaHCO3 25，NaH2PO4· 2H2O 1.25，CaCl2 1.2，MgCl2·6H2O 1.2，glucose 11，丙酮酸钠3，抗坏血栓钠1。
切片液(section solution)，配方(mmol/L)：sucrose 90，NaCl 60，NaHCO3 26.5，KCl 2.75，NaH2PO4·2H2O 2.5，CaCl2 1，MgCl2·6H2O 5，glucose 9，丙酮酸钠3，抗坏血栓钠1。
电极内液(internal solution)，配方(mmol/L)：potassium gluconate 130，KCl 5，MgCl2·6H2O 2，Hepes 10，EGTA 0.1，Na2-ATP 2，Na2-GTP 0.2。
Orexin-A购置于英国Tocris Bioscience公司, DNQX、MK801、Picrotoxin、河豚毒素(TTX)均来自于美国Med Chem Express公司，orexin-1/2型受体一抗来自于中国Bioss生物技术公司，vglut1一抗、GAD 67一抗和NeuN一抗均来自于美国Millipore生物技术公司。主要仪器：PH测试仪(中国医药集团有限公司)，玻璃微电极自动拉制仪(美国，Sutter P-97)，振动切片机(德国，Leica VT-1200s)，双通道膜片钳放大器(美国，Axon 700B)，相差显微镜(日本，Olympus BX51WI)，红外成像系统(美国，Dage-MTI IR-1000)，显微操作仪(美国，Sutter)。
1.3 免疫荧光染色
脑组织按照常规方法制备冰冻切片，将包含SLD脑区的脑组织冠状切成16 μm的脑片，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次。配置含1% Triton和10%驴血清的封闭打孔混合液，将脑片置于混合液中在37 ℃下孵育40 min，随后配置合适浓度的一抗孵育液：vglut1(1 :1 000)、GAD 67(1 :500)、orexin-1/2型受体(1 :500)、NeuN(1 :2 000)，将脑片置于配制好的一抗中在4 ℃冰箱孵育过夜。孵育好之后，再次用PBS缓冲液漂洗3次，随后用对应的二抗在室温下避光孵育2 h，然后再次重复漂洗操作。最后将漂洗好的脑片进行贴片，风干后用封片剂进行封片，封片完成后即可在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察相应实验目标的表达模式或形态特征。
1.4 包含SLD脑区的脑干冠状切离体脑片的制备
出生后8~14 d的SD乳大鼠，用异氟烷进行气体麻醉后，快速将其断头，小心将颅骨剥开暴露出脑组织，并将完整的脑组织拨到装有冷冻过后切片液的培养皿中进行修块，在不损伤SLD脑区的前提下将脑组织修成近似的正方体，然后将修好的脑组织转移至振动切片机的凹槽内固定，缓慢倒入冷冻后的切片液，开始进行切片。根据实验要求，采用冠状切的方式，制备厚度为300 μm的包含SLD脑区的脑干离体脑片，并将切好的脑片转移到通有5% CO2和95% O2的混合气的ACSF中孵育40 min，即可进行膜片钳实验。
1.5 全细胞膜片钳记录
1.5.1 SLD神经元封接与记录
将孵育好的包含SLD脑区的离体脑干脑片转移至灌流系统的孵育槽中，用压网固定好，在室温下(25~35 ℃)持续灌流通有5% CO2和95% O2混合气的新鲜ACSF，流速为2 mL/min。然后在红外相差显微镜下准确定位SLD脑区的范围，并在目标区域筛选边界清晰、实质感强、表面光滑的神经元。打开pClamp记录软件，然后打开封接测试的界面，通过给予测试脉冲(5 mV，5 ms)来实时监测封接情况。通过三维立体显微操作仪和相差显微镜，用灌有电极内液的玻璃微电极(3~5 MΩ)对筛选好的SLD神经元进行封接，然后将神经元逐步钳制到-70 mV，直至封接电阻上升至G欧水平，待封接稳定后，通过短促的吸力由弱到强地对目标神经元进行破膜，从而形成膜片钳的全细胞记录模式，接下来在电流钳模式下对该神经元进行记录，并实时监测串联电阻，保证记录完成前后串联电阻的变化不超过20%。
1.5.2 SLD神经元膜电位分析
在电流钳模式下，将所有记录的SLD神经元的膜电位水平钳制到-60 mV左右，采用DNQX、MK 801、picrotoxin和TTX来阻断化学突触的传递，通过灌流orexin-A来研究orexin对SLD神经元的膜电位的调控作用。通过灌流泵持续灌流2 min 100 nmol/L的orexin-A，选取正在记录的SLD神经元在灌流orexin-A(100 nmol/L)之前基本稳定的10 s，用Clampfit计算出这一时间段内膜电位的平均值作为对照，然后选取正在记录的SLD神经元在灌流orexin-A引起的反应达到平台期后基本稳定的10 s，用同样的方法计算出加入orexin-A后膜电位的平均值，将两个膜电位进行比较。
1.5.3 SLD神经元膜电位阈下振荡分析
在加入orexin-A之前，采用MATLAB对SLD神经元膜电位不同频段的阈下振荡进行滤波获取后，选取各频段振荡较为稳定的30 s，计算其功率作为对照，在orexin-A诱发的去极化反应达到平台期后，同样选取各频段振荡较为稳定的30 s计算其功率，分析orexin对SLD神经元膜电位不同频段阈下振荡的影响。
1.5.4 SLD神经元膜电位阈下振荡自相关分析
对加入orexin-A前后SLD神经元膜电位delta和theta频段阈下振荡进行自相关分析，在时间lag=0的点两侧出现的峰为自相关系数，代表了振荡的规则程度，分别比较加入orexin-A前后delta和theta频段阈下振荡的自相关系数。
1.5.5 SLD神经元放电与膜电位阈下振荡相位锁定分析
将记录到的全细胞膜电位进行带通滤波，其中1~4 Hz的带通滤波可得到delta频段膜电位阈下振荡，4~12 Hz的带通滤波可得到theta频段膜电位阈下振荡，此时将不同频段的阈下振荡进行希尔伯特变换(Hilbert transform)，可转化出每一时刻点对应的振荡相位。对放电活动与膜电位振荡关系的锁相分析是在该段膜电位记录中，对产生了放电活动的时刻(以锋电位产生时刻作为标准)相应的振荡相位的分布进行Rayleigh氏球形均一性检验，如存在相位锁定关系，则说明放电活动主要集中在某一特定相位附近出现，统计报告P < 0.05。此时，可用每一放电对应相位值的加权平均值来表示锁相关系的平均相位值，代表了放电活动主要在膜电位振荡的某一特定相位时刻产生。
1.6 统计学分析
数据均采用 x±s的方式表示，数据分析处理与图像制作均采用Clampfit、Origin和Graphpad Prism软件完成，数据统计分析采用SPSS 22，当数据分布符合正态分布时采用配对t检验或两独立样本t检验，不符合正态分布时采用Wilcoxon符号秩和检验进行统计检验。检验水准：α=0.05。
2 结果
2.1 SLD神经元大多数表现为vglut1和orexin-1/2型受体阳性
采用vglut1和GAD 67对SLD脑区进行免疫荧光染色，发现在该区域存在大量vglut1阳性的谷氨酸能神经元，只有少量GAD 67阳性的GABA能神经元散在分布(图 1A)。3只实验动物同一SLD区域中谷氨酸能神经元和GABA能神经元的计数结果显示，在该统计区域，所有参与计数的谷氨酸能神经元和GABA能神经元中，97.4%的神经元均为谷氨酸能神经元，而GABA能神经元比例极低。采用orexin-1/2型受体对SLD神经元进行免疫荧光标记，结果显示在SLD脑区，orexin能受体中等程度地表达于SLD神经元上(图 1B)。Orexin-1/2型受体与NeuN进一步的免疫荧光双标结果显示，大部分SLD神经元均表达orexin受体(图 1C)，扩大数据量对3只动物同一SLD区域中不表达orexin受体的神经元和表达orexin受体的神经元的数量进行统计分析，发现在所有计数的136个神经元中，有91个(66.9%)神经元均表达orexin受体。上述结果表明在SLD脑区，大部分SLD神经元均表达orexin受体，orexin可能通过作用于orexin受体进而调控SLD脑区orexin受体阳性神经元的活动。
2.2 Orexin导致SLD神经元膜电位的去极化以及阈下振荡水平的增强
在电流钳模式下，将所有记录的SLD神经元的膜电位水平钳制到-60 mV左右，并全程灌流DNQX(50 μmol/L)、MK801(100 μmol/L)、picrotoxin(100 μmol/L)和TTX(1 μmol/L)。在此条件下，灌流2 min的orexin-A(100 nmol/L)在记录到的对orexin有反应的7个SLD神经元上引起了明显的去极化反应(去极化幅度：7.56±1.47 mV, n=7, 配对t检验，P < 0.01，图 2A、B)并增强了SLD神经元膜电位的阈下振荡(图 2C)。频谱分析结果显示，orexin-A明显增强了SLD神经元膜电位阈下振荡的在低频段的功率谱密度(power spectral sensity，图 2D)。7例神经元的统计数据表明，orexin-A显著增强了0.5~25 Hz频段内SLD神经元膜电位阈下振荡的总功率(对照：2.54±1.30 mV2；orexin：7.98±2.52 mV2，n=7，非参检验，P < 0.05，图 2E)。因此，orexin可以不依赖于化学突触直接影响SLD神经元膜的特性，对其膜电位水平和膜的振荡均起促进作用。
2.3 Orexin主要增强SLD神经元膜电位阈下振荡在delta和theta频段的功率
0~25 Hz主要包括delta(1~4 Hz)、theta(4~12 Hz)、beta(15~25 Hz)这3个频段，其原始波形显示，在加入orexin-A后各频段的振荡幅度均明显增强(图 3A、B、C)。对各频段的功率变化进行统计分析，结果显示，加入orexin-A之后，delta(对照：1.93±1.16 mV2；orexin：5.90±2.01 mV2，n=7，非参检验，P < 0.05)和theta(对照：0.50±0.22 mV2；orexin：1.85±0.84 mV2，n=7，非参检验，P < 0.05)频段振荡的功率显著增强，beta(对照：0.10±0.06 mV2；orexin：0.23±0.08 mV2，n=7，非参检验，P=0.18)频段则无统计学差异(图 3D)。除低频振荡外，SLD神经元还存在高频的阈下膜电位振荡，例如low gamma(25~48 Hz)和high gamma(52~150 Hz)频段。高频段膜电位信号分析结果显示，加入orexin-A之后，low gamma(对照：0.05± 0.03 mV2；orexin：0.06±0.02 mV2，n=7，非参检验，P=0.24)和high gamma(对照：0.02± 0.01 mV2；orexin：0.02±0.01 mV2，n=7，非参检验，P=0.24)频段振荡的功率在加入orexin-A前后无统计学差异(图 3E、F、G)。以上结果表明orexin主要增强了SLD神经元在delta和theta频段的膜电位阈下振荡的功率。
2.4 Orexin通过前移放电与delta频段膜电位振荡的锁定相位提高SLD神经元的放电效率
在电流钳模式下，将所记录的SLD神经元钳制到-60 mV左右，并全程灌流DNQX(50 μmol/L)、MK801(100 μmol/L)和picrotoxin(100 μmol/L)以阻断化学突触传递。灌流2 min的orexin-A(100 nmol/L)在记录到的对orexin有反应的7个SLD神经元上均引起了明显的去极化反应，并在其中5个神经元上诱导出了放电活动(放电频率：1.31±0.53 Hz，图 4A)。时间频谱分析结果显示，加入orexin-A后，SLD神经元膜电位阈下振荡信号在delta和theta频段的功率谱密度明显增强，且更加连续(图 4B、C)。SLD神经元在delta频段的阈下振荡信号自相关分析结果显示，加入orexin-A之后，SLD神经元膜电位在delta频段的阈下振荡的规则程度与对照没有统计学差异(对照：0.24±0.02；orexin：0.20±0.02，n=7，配对t检验，P=0.15，图 4D、E)。设置4例SLD神经元为对照组，将其从-60 mV的钳制电位直接去极化钳制到-53 mV左右(100 nmol/L orexin-A引起SLD神经元的平均去极化水平)，这4例SLD神经元均被诱导出放电活动，并以orexin引起放电的5例SLD神经元为实验组。膜电位和放电时刻的相位锁定分析结果显示，实验组和对照组SLD神经元的放电活动均能稳定地锁定到delta频段膜的电位上，而且实验组SLD神经元的放电与delta频段膜电位振荡的锁定相位相较于对照组明显前移(对照：1.36±0.11，n=4；orexin：0.62±0.26，n=5，非配对t检验，P < 0.05，图 4F、G)，上述结果表明orexin使得SLD神经元的放电可以相对于delta频段膜电位阈下振荡前移，即可以在膜电位更低的情况下产生放电，降低了SLD神经元放电的阈值。
2.5 Orexin通过稳定SLD神经元膜电位信号在theta频段的阈下振荡来稳定神经元放电
时间频谱分析结果显示，加入orexin-A后，SLD神经元膜电位阈下振荡信号在theta频段更加连续和稳定(图 5A、B)。进一步的自相关分析结果显示，orexin-A明显增加了SLD神经元膜电位在theta频段振荡的自相关系数(对照：0.25±0.04；orexin：0.32±0.05，n=7，配对t检验，P < 0.05，图 5C、D)。以上结果表明，SLD神经元在theta频段存在较为稳定的阈下膜电位振荡，而orexin使得SLD神经元膜电位在theta频段的阈下振荡更加规则、连续和稳定。相位锁定分析结果表明，实验组SLD神经元放电与theta频段膜电位的锁定相位与对照组没有统计学差异(对照：0.75±0.04，n=4；orexin：0.75±0.06，n=5，非配对t检验，P=0.50，图 5E、F)。以上结果提示orexin可以通过稳定SLD神经元膜电位在theta频段的阈下振荡来稳定神经元放电，提高神经元的放电效率并促进神经元网络的同步化放电。
3 讨论
本研究采用膜片钳技术，研究orexin对SLD神经元兴奋性及膜电位阈下振荡的调控作用，实验结果证明，orexin对SLD神经元的活动具有调控作用，提高了SLD神经元的兴奋性并增强了SLD神经元的放电能力。然而，orexin对SLD神经元活动的下游调控机制及这一调控通路的生理意义尚不清楚。
尽管orexin神经元胞体局限地分布于LHA以及PeF区域，但其发出的神经纤维广泛地分布于整个皮层及皮层下神经系统，通过释放orexin神经肽并作用于突触后orexin受体参与了机体多种生理功能的调控[8]。迄今为止，除研究报道发现视交叉上核神经元orexin受体的激活发挥直接的抑制性调控作用之外[9]，突触后orexin受体的激活主要对神经元产生兴奋性效应。例如：在前额叶皮层2/3层[10]、小脑的间位核[11]、蓝斑核[12]等等，orexin均是通过激活突触后orexin受体对其神经元发挥一个兴奋性调控作用。我们采用全细胞膜片钳技术，通过外源性加入orexin可以直接观察orexin对SLD神经元的调控作用。发现在SLD区域，orexin可以直接去极化SLD神经元从而产生一个兴奋效应，这与既往的报道相互印证，说明orexin主要对SLD脑区和SLD神经元发挥兴奋性调控作用。
我们在研究过程中发现orexin对SLD神经元的兴奋效应不仅仅只表现为膜电位的去极化，还表现为更加复杂的SLD神经元膜电位阈下振荡的增强及其引起的神经元放电模式的改变。已有研究表明，神经元膜电位的阈下振荡可以影响神经元放电的频率、精确度以及时机[13-15]。例如有研究报道，豚鼠额叶皮层神经元持续的膜电位振荡可以使神经元产生特定频率的电信号，而且更倾向对同一频率的传入信号做出反应，因此使得特定频率的电信号在神经元网络中扩布[16]。基于神经元膜电位阈下振荡的重要功能，我们进一步研究了SLD神经元膜电位阈下振荡及其与放电的关系以及orexin对两者的调控作用，发现SLD神经元膜电位存在不同频段的阈下振荡，而orexin主要增强了SLD神经元在delta和theta频段的膜电位阈下振荡的功率。对SLD神经元delta频段阈下振荡的分析结果表明，orexin主要通过前移SLD神经元delta频段膜电位阈下振荡与放电的锁定相位，降低SLD神经元放电的阈值，从而提高SLD神经元的兴奋性，增加SLD神经元的放电频率。与之不同的是，对theta频段阈下振荡的分析结果显示，orexin则是通过稳定SLD神经元膜电位在theta频段的阈下振荡来稳定神经元放电，从而使神经元放电更加规则有序。以上结果表明，orexin对SLD神经元膜电位在delta和theta频段阈下振荡的这两种不同的调控作用共同促进了SLD神经元的放电，使SLD神经元的放电更加稳定高效。
与上述推论一致的是，膜片钳记录结果显示，orexin确实可以增加SLD神经元的放电频率。因此，orexin可以通过调控SLD神经元膜电位水平和膜电位阈下振荡间接影响神经元放电的模式。既往研究表明，机体各项生理功能的实现依赖于神经元的放电活动，例如：orexin可以通过对浦肯野细胞直接的突触后兴奋性效应，增加其放电活动，从而参与小脑介导的运动行为的调控[17]；orexin可以直接兴奋6b层皮层神经元，增加神经元的放电活动，促进随意运动的发生[18]；下丘脑orexin能系统还可以通过突触后兴奋效应引起神经元放电，增强前庭外侧核对外界信息响应后的整体输出以及其反应敏感性，从而参与前庭外侧核介导的躯体姿势调控[19]。目前的实验结果表明orexin不仅能直接增加SLD神经元的放电频率，还能够通过调控SLD神经元膜电位的阈下振荡影响神经元放电的模式，使其放电更加稳定、高效、规则，并有可能趋于同步化。我们所关注的SLD区域，SLD神经元的特征性同步化放电是REM睡眠的转换和维持的核心机制[20]，这说明orexin很有可能通过调控SLD神经元的放电活动参与了SLD介导的REM睡眠调控的关键环节，orexin能系统的缺陷也很有可能导致REM睡眠的障碍。与我们的猜想一致，已有临床研究表明，orexin能系统缺陷的病人除觉醒维持困难外，还表现为明显的REM睡眠状态的异常，包括REM睡眠行为障碍、睡眠麻痹等。
综上所述，本研究揭示orexin对SLD神经元具有调控作用，不仅能增强SLD神经元的兴奋性，还能增强并稳定SLD神经元膜电位低频段的阈下振荡，有可能使SLD神经元的放电更加稳定高效。此外，SLD神经元膜电位振荡与放电有稳定的锁相关系，而orexin可以将这一锁相关系前移，从另一个方面促进SLD神经元的放电。Orexin对SLD神经元调控作用的相关机制及其与REM睡眠的关系还有待进一步研究。